Los vitrales son quizá uno de los elementos más importantes de la Catedral. Fueron diseñados por famosos artistas de Europa y América. Los primeros ubicados en la cúpula y las capillas del primer piso, fueron diseñados por Nicolás Rambusch y elaborados en Italia por Guido Polloni.
En los años 60 el párroco Adolfo Hoyos Ocampo, ubicó un taller de vidrieras dirigido por el español Ismael Font, en el lugar que hoy ocupa la cripta. Allí se elaboró el vitral de la Virgen que ocupo el rosetón sobre las puertas centrales y que en 1968 fue retirado para instalar uno diseñado en Cali que se destaca por las múltiples rosas que acompañan la imagen.
Otros vitrales que se exhiben son los elaborados por la Casa Hermanos HyGerente de París y que inicialmente se ubicaron en la Catedral de Bogotá y fueron entregados a Manizales a raíz de remodelación a que fue sometida en 1968 con motivo de la visita del Papa Pablo VI a Colombia.
Los vitrales de la Encarnación y la Redención fueron elaborados en el taller Velasco de Cali y diseñados por artistas como Alberto Martorell compañero de Picasso y de Miró en la Academia de París y Leandro Velasco.
El vitral más representativo es el de La Piedad o el Descendimiento de la Cruz elaborado por Ch. Champigneulle en París, ubicado en la capilla penitencial y traído de Francia por el arzobispo Arturo Duque.
Restauración
La Catedral Basílica Nuestra Señora del Rosario de Manizales, luce hoy como en los años cuando fue construida. Después de las restauraciones que la curaron de la carbonatación del concreto y de un estricto reforzamiento estructural, se continúa con el trabajo de recuperar 800 metros de vitrales que engalanan sus cuatro fachadas. De este empeño hacen parte el Ministerio de Cultura con un aporte de 1.000 millones, la Arquidiócesis de Manizales con 330 millones, la Gobernación de Caldas con $2.900 millones provenientes de regalías, y la junta cívica con $619 millones recaudados a través de actividades con la comunidad.
Los 141 vitrales que posee el templo fueron importados de talleres Italia, Francia y Holanda, algunos de ellos fabricados en la Casa Velasco de Cali, exquisitas obras de arte entre las que sobresalen el Bautismo de Jesús, la Cena Pascual, la Última Cena, El descendimiento, La Redención. El rosetón central fue diseñado en Cali por el artista español Mario de Ayala Moya.